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          免疫組化操作技巧
          點擊次數:2141 更新時間:2019-03-13

          免疫組化ABC法

           

          一)、儀器設備
             1)18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐;
              2)水浴鍋

          (二)、試劑 
              1)PBS緩沖液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。
              2)0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB,pH6.0,1000ml):檸檬酸三鈉 3g,檸檬酸 0.4g。
              3)0.5mol/L EDTA緩沖液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。
              4)1mol/L的TBS緩沖液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris堿,用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。
              5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
              6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
              7)封裱劑:
              a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0~9.5)等量混合;
              b、油和TBS(或PBS)配制。 
              8)TBS/PBS pH9.0~9.5,適用于熒光顯微鏡標本;pH7.0~7.4適合于光學顯微鏡標本。

          )、   
              SABC法
              1)脫蠟、水化。
              2)PBS洗兩次各5分鐘。
              3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2,室溫封閉5~10分鐘,蒸餾水洗3次。
              4)抗原修復。
              5)PBS洗5分鐘。
              6)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
              7)滴加抗小鼠抗(合適的濃度,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時 

            (4℃過夜后在37℃復溫45分鐘)。
              8)PBS洗三次每次2分鐘。
              9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分鐘。
              10)PBC洗3次每次2分鐘。
              11)滴加試劑SABC,20℃~37℃20分鐘。
              12)PBS洗4次每次5分鐘。
              13)DAB顯色:DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。
              14)蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。
              15)脫水、透明、封片、鏡檢。

           

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