阿維菌素（IVM）ELISA檢測試劑盒

使用說明書

一、檢測原理

本試劑盒利用阿維菌素抗體與阿維菌素可產生特異性結合的性質，先在酶標板上預包被抗原，再加入標準品（樣本）和阿維菌素抗體，樣本或標準品中的阿維菌素藥物與固定在酶標板上的抗原競爭阿維菌素抗體，后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標準品（樣本）中阿維菌素藥物的含量成反比。

二、檢測范圍

本試劑盒是應用ELISA技術研發(fā)的藥物殘留檢測產品，與儀器分析技術比較，能經濟、快速地檢測組織以及液態(tài)奶樣本中的阿維菌素。

三、交叉反應率

阿維菌素類……………………………………………100%

伊維菌素………………………………………………25%

埃普菌素………………………………………………10%

多拉菌素………………………………………………6%

四、試劑盒組成

酶標板1塊，96孔/板

標準液6瓶（1 mL/瓶）：

0ppb,0.5ppb,1.5 ppb，4.5ppb,13.5ppb,40.5ppb

酶標記物稀釋液 ………………………………………7mL

11×酶標記物濃縮液………………………………0.7mL

底物液A ………………………………………………7mL

底物液B………………………………………………7mL

終止液…………………………………………………7mL

20×濃縮洗滌液……………………………………30mL

復溶工作液………………………………50mL

組織樣本處理液……………………………10mL

說明書……………………………………1份

五、使用單位需自備的設備及試劑

（1）儀器

微孔板酶標儀(450 nm/630 nm)

振蕩器

離心機

渦旋儀

粉碎機

電子天平（感量0.01 g）

（2）器材

單道微量移液器：20 μL～200 μL，100 μL~1000 μL

多道微量移液器：30 μL～300 μL

（3）試劑

甲醇、去離子水

六、溶液的配制

樣本前處理需配制：

配液1：洗滌工作液

用去離子水將濃縮洗滌液（20×）按1 : 19體積比進行稀釋，即1份濃縮洗滌液加19份去離子水。

七、樣本前處理方法

樣本處理前須知：

處理任何樣本時，都須注意：

（1）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（2）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結果。

樣本前處理步驟：

組織：

1、 準確稱取2±0.05g均質后的組織樣品于10 mL離心管中；

2、 依次加入2mL甲醇，100μL組織樣本處理液，充分渦動5 min使樣本分散；

3、 室溫下（25±2℃），4000 g離心10 min；

4、 取200μL上清液加入400μL復溶工作液中，渦動10s混勻；

5、 取50 μL用于分析。

原奶：

1、 取1mL液態(tài)奶于10 mL離心管中；

2、 加入3mL甲醇，充分渦動1 min；

3、 室溫下（25±2℃），4000 g離心10 min；

4、 取200μL上清液加入400μL復溶工作液中，渦動10s混勻；

5、 取50 μL用于分析。

八、酶聯(lián)免疫檢測步驟

測定前須知：

1、使用之前將所有試劑和需用微孔板回升至室溫。

2、使用之后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

3、在使用中不要讓微孔干燥。 

4、在ELISA分析中的重復性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

5、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

測定步驟：

1、將所需試劑和微孔板從冷藏環(huán)境中取出，在室溫下平衡30 min，每種液體使用前均須搖勻。注意標準液均需做2個平行試驗。

2、酶標記物工作液：取1份11×酶標記物濃縮液加10份酶標記物稀釋液按照1:10的比例稀釋即得。

3、加標準品：加標準品/樣本50 mL/孔到對應的微孔中，加入酶標記物50 mL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應30 min。

4、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加洗滌液 300μL/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗滌4~5次，用吸水紙拍干。

5、顯色：加入底物液A液50 mL/孔，再加底物液B液50 mL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應15 min。

6、測定：每孔各加50 μL終止液，設定酶標儀在450 nm處，測定OD值（建議用450/630 nm雙波長檢測，在5 min內讀完數(shù)據）。

九、結果分析

所測得的標準液或樣品吸光度的平均值（B）除以DI一個標準液（0標準液）的吸光度（B₀）值再乘以100%，得到百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝

以標準品濃度的10為底的對數(shù)為X軸， 百分吸光值為Y軸，繪制標準曲線。將樣本的百分吸光值代入標準曲線，從標準曲線上讀出樣本所對應的值，作為10的冪，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中所含阿維菌素的量。

利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

九、樣本稀釋倍數(shù)

組織： 6倍

液態(tài)奶： 10倍

十、試劑盒靈敏度、準確度、精密度

試劑盒靈敏度：0.5ppb

樣本低檢測限：

組織……………………………………4 ppb

液體奶…………………………………5 ppb

回收率：90%±30%

精密度：試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十一、注意事項

1、室溫低于20 ℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20~25 ℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象，所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚；若不慎滴漏到皮膚上，請盡快用水沖洗。

4、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

5、保存試劑盒于2~8 ℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

6、顯色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質，應當棄之；0標準的吸光度（450 nm）值小于0.5（A_450nm< 0.5）時，表示試劑可能變質。

7、在加入底物液后，一般顯色15 min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到20 min（或更長），但不得超過30 min；反之，則減短反應時間。

8、該試劑盒zui佳反應溫度為25 ℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十二、貯藏條件及保存期

貯藏條件：在2~8 ℃保存試劑盒。

保存期：本試劑盒有效期為12個月。