輔酶ⅠNAD(H)含量測定試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取 2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

輔酶 NAD(H)Ⅰ廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD⁺是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要氫受體，生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成 ATP 的同時，形成大量的 ROS，同時 NADH 再生為 NAD⁺。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD⁺比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環(huán)的強弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD⁺比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD⁺降解產(chǎn)物對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測定原理

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD⁺和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測吸光值；而NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進(jìn)一步采用MTT還原法檢測。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

酸性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 3 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周；

試劑四：粉劑×1 瓶，4 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周；

試劑五：液體 3.6mL×1 瓶，4 ℃保存；

試劑六：液體 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

試劑七：液體 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

NAD⁺和NADH的提取

1  血清（漿）中 NAD⁺和NADH的提取

NAD⁺的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；

冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建

議取約0.1mL 血清（漿），加入 1mL 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2  組織中 NAD⁺和NADH 的提取：

NAD⁺的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g組織，加入 1mL 堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3  細(xì)胞或細(xì)菌中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎 1min（冰浴，強度20％或200W，超聲2s，停1s），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：堿性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎 1min（冰浴，強度 20％或 200W，超聲2s，停1s），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加樣）：

混勻，取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下讀取對照吸光值A(chǔ)1和測定管吸光值 A2，計算△A=A2-A1。

注意事項

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管，本試劑盒100管保證測48個NAD⁺或 NADH.

NAD⁺和NADH含量的計算

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（一）NAD⁺含量的計算

1、血清（漿）中 NAD⁺含量計算

NAD⁺含量(nmol/mL）=[(△A -0.099）×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD⁺含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NAD⁺(nmol/mg prot）=[(△A-0.099）×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)

=36.1×(△A-0.099）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NAD⁺(nmol/g 鮮重）= [(△A-0.099）×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)

= 72.2×(△A -0.099）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NAD⁺(nmol/10⁴cell）=[(△A -0.099）×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099）

（二）NADH 含量的計算

1、血清（漿）中NADH含量計算

NADH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADH (nmol/mg prot）= [(△A-0.065）×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)

= 24.7×(△A -0.065）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)

= 49.4×(△A -0.065）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NADH (nmol/10⁴cell）= [(△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)

=0.0988×(△A -0.065）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（一）NAD⁺含量的計算

1、血清（漿）中 NAD⁺含量計算

NAD⁺含量(nmol/mL）=[ (△A -0.099）×72.2×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 1444×(△A -0.099）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD⁺含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=[(△A-0.099）×72.2×V1)]÷(V1×Cpr)

= 72.2×(△A -0.099）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NAD⁺ (nmol/g 鮮重）= [(△A-0.099）×72.2×V1)]÷(W×V1÷V2)

= 144.4×(△A -0.099）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NAD⁺(nmol/10⁴cell）=[(△A -0.099）×72.2×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.2888×(△A -0.099）

（二）NADH 含量的計算

1、血清（漿）中 NADH 含量計算

NADH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.065）×49.4×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 988×(△A -0.065）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADH (nmol/mg prot）= [(△A-0.065）×49.4×V1) ]÷(V1×Cpr)

= 49.4×(△A -0.065）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.065）×49.4×V1) ]÷(W×V1÷V2)

= 98.8×(△A -0.065）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NADH (nmol/10⁴cell）= [(△A-0.065）×49.4×V1) ]÷(500×V1÷V2)

=0.1976×(△A -0.065）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

注意：低檢測限為 1nmol/mL 或 或 1nmol/g  鮮重 或 或 0.01nmol/mg prot

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