Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）說(shuō)明書(shū)

6×His-Tagged Protein Purification Kit 

目錄號(hào)：  K0894       

保    存：  蛋白酶抑制劑混合物，-20℃；  其它組分，2-8℃。 

組分說(shuō)明 

Cat.No.                 K0894         K0894A

KitSize                     2ml            5ml

Ni-Agarose 填料                2ml            5ml

細(xì)菌裂解液                   25ml           65ml

1MTris（pH7.9）               6ml           15ml

1M  咪唑                    25ml          65ml

3M 氯化鈉                    50ml         2×60ml

蛋白酶抑制劑混合物             0.3ml          0.7ml

親和柱空柱                  1個(gè)(6ml)      1 個(gè) (12ml)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

      本試劑盒包含Ni-Agarose 填料、親和柱空柱以及可溶性His 融合蛋白純化所需的全部試劑（細(xì)菌裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液組分），使用方便。該鎳柱純化系統(tǒng)對(duì)6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有 6 個(gè)組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白。該系統(tǒng)具有4 個(gè) Ni2+ 螯合位點(diǎn)，較只有3 個(gè)螯合位點(diǎn)的Ni-IDA 結(jié)合 Ni2+ 更為牢固，有效防止純化過(guò)程中 Ni2+ 脫落且增強(qiáng)對(duì) His 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力，提高純化效率。較高的基團(tuán)密度，大大提高了蛋白載量。該系統(tǒng)在天然或變性條件下，對(duì)來(lái)源于各種表達(dá)系統(tǒng)（如桿狀病毒，哺乳細(xì)胞，酵母以及細(xì)菌）中的His 標(biāo)簽蛋白，均有很好的純化效果。本產(chǎn)品已螯合鎳離子，可直接用可溶性蛋白的純化，使用方便，快捷。

      支 持 物： CL-6B 瓊脂糖凝膠

      載量：20-30mgHis標(biāo)簽蛋白/ml 填料

      粒徑：50-160 μm

注意事項(xiàng) 

 1. 在純化之前采用電泳檢測(cè)蛋白的可溶性，本試劑盒只適合于可溶性蛋白的純化，如需純化包涵體蛋白，請(qǐng)選擇我公司的包涵體蛋白純化試劑盒，貨號(hào)為K0893。

 2. 緩沖液中不建議使用 β-巰基乙醇、DTT 和EDTA。

 3. 整個(gè)純化過(guò)程中切忌凝膠脫水變干。

 4. 為提高純化效率，首先確定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的*使用濃度。必要時(shí)可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度，BindingBuffer 的范圍為 0-10mM，洗脫緩沖液的范圍為10-500mM來(lái)進(jìn)行。并通過(guò)SDS-PAGE或WesternBlotting 來(lái)檢測(cè)目的蛋白的純度。

 5. 請(qǐng)使用高純度的試劑配制緩沖液，并通過(guò)0.22µm 或者0.45µm 過(guò)濾器過(guò)濾。為避免柱子被堵塞，建議將裂解液進(jìn)行離心，或者使用0.22µm 或者0.45µm 過(guò)濾器過(guò)濾。

  6. 柱再生時(shí)，保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。

操作步驟 

組裝層析柱 

  1. 將填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10 分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開(kāi)，讓乙醇通過(guò)重力作用緩慢流出。

      注意：（1）填料的上層是乙醇保護(hù)層，將填料和乙醇一起混勻，以每ml填料純化20-30mgHis標(biāo)簽蛋白計(jì)算，取需要的填料與乙醇的混合 液加入層析柱。

（2）如果乙醇不流出，可以給柱子一個(gè)外力，例如用大拇指對(duì)柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。

（3）本實(shí)驗(yàn)都是通過(guò)重力作用使溶液流出。

  2. 向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用 10 倍柱體積的Binding Buffer 平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣。

注意：柱體積指的是填料的體積。

可溶性蛋白的純化（BindingBuffer和ElutionBuffer配方詳見(jiàn)附表1） 

  1.  收集菌體后，每100mg菌體（濕重）加入1-5 ml細(xì)菌裂解液（每1ml 細(xì)菌抽提試劑中已加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物），超聲裂解菌體。

注意：（1） 當(dāng)提取物粘度高或提取蛋白為包涵體時(shí)，建議加入DNaseI和Lysozyme。每1ml 細(xì)菌抽提試劑中加入1μlDNaseI（1,000U/ml），2μlLysozyme（50mg/ml），DNaseI和Lysozyme可單獨(dú)從我公司購(gòu)買，貨號(hào)：Lysozyme(#YJ0887)、 DNaseI(#YJ2090A)，如使用其它公司產(chǎn)品，請(qǐng)按照相應(yīng)說(shuō)明書(shū)操作。

（2）超聲過(guò)程中保持菌液處于冰浴中，超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率，探頭種類，容器的大小形狀，需實(shí)驗(yàn)中自己摸索，應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱，可分成短時(shí)間，多次超聲，通過(guò)一定的間隔時(shí)間避免溶液過(guò)熱。終以菌液變清即可。

  2.  10000rpm,4℃離心3分鐘，收集上清中的可溶性蛋白。

  3.  用BindingBuffer將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/小時(shí)，收集流穿液。

注意：（1）本試劑盒中附帶有一塊篩板，使用時(shí)先將篩板加至填料的上層，該篩板可用于雜質(zhì)較多的蛋白的過(guò)濾，防止過(guò)多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負(fù)載上柱，但是篩板放入柱子后就不易取出。

（2）通過(guò)控制加入的菌體裂解液的速度來(lái)控制流速。

  4.  使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。

  5.  使用適量Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。

      注意：洗脫峰可以分管收集，每1ml收集1管，并采用蛋白監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)，收集洗脫峰。

  6.  洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒(méi)），4℃保存。

      注意：如果是分段梯度洗脫，大洗脫緩沖液中咪唑濃度未達(dá)到500mM時(shí)，則使用濃度為500mM的咪唑進(jìn)行洗脫10倍柱體積后，再進(jìn)行第6步的操作。

柱再生

      當(dāng)填料使用多次后，結(jié)合效率會(huì)有所下降（表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍(lán)綠色），可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

  1. 使用2 倍柱體積的6M鹽酸胍沖洗后，使用3 倍柱體積的去離子水沖洗。

  2. 使用1 倍柱體積2% SDS沖洗。

  3. 依次使用1倍柱體積的25%、50%、75%和5 倍柱體積100%乙醇沖洗，再依次使用 1 倍柱體積的75%、50%、25%的乙醇沖洗。             

 4. 使用1 倍柱體積的去離子水沖洗。

 5. 使用5 倍柱體積含50 mM EDTA 緩沖液（PH8.0）沖洗。

 6. 使用3 倍柱體積去離子水，3 倍柱體積20%乙醇沖洗。

 7. 4°C 保存。

 8. 再次使用前，需首先使用10 倍柱體積去離子水沖洗，然后使用5個(gè)柱體積50 mM NiSO4再生，3 個(gè)柱體積的Binding Buffer平衡。

                                         附表  1. 可溶性蛋白純化緩沖液配方

                                                         

成分                   Tris-HCl（PH7.9）   咪唑       NaCl

SolubleBindingBuffer       20mM          10mM       0.5M

SolubleElutionBuffer       20mM        500mM         0.5M



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