RIPA 裂解液(中)

多種成分均可以從細胞中提取總蛋白，如 Triton、SDS、NP-40 等。RIPA 裂解液（中）

(RIPA Lysis Buffer)是采用一種經(jīng)典的細胞組織快速裂解并獲得總蛋白的裂解液，其裂解強度大于 NP-40 裂解液、RIPA 裂解液(弱)。所獲得的蛋白質(zhì)可用于 Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)等。

Medium RIPA Lysis Buffer 主要由 Tris 、NP-40、sodium deoxycholate 等組成， 含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

產(chǎn)品組成：

Medium RIPA Lysis Buffer

PMSF(100mM)

100ml

1.5ml

-20℃

-20℃

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細胞

1、取 Medium RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2、去除貼壁細胞的培養(yǎng)液，用 PBS、NS 或無血清培養(yǎng)液清洗 1 次，低速離心，棄上清， 留取沉淀。

3、按照 6 孔板每孔加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 Medium RIPA Lysis Buffer 。移液器輕輕吹打，使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上或 4℃裂解 15～ 30min，通常裂解液作用于細胞 1～3 秒內(nèi)，細胞就會被裂解。通常 6 孔板每孔細胞加入 100μl 解液已經(jīng)足夠，如果細胞密度很高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到 200～250μl。

4、10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

5、進行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細胞

1、取 Medium RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2、低速離心懸浮細胞，棄上清，收集沉淀。

3、用手指輕彈細胞，使其松散。按照 6 孔板每孔細胞加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 Medium RIPA Lysis Buffer 。通常 6 孔板每孔細胞加入 150μl 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到 200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。

4、10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

5、進行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)組織樣本

1、取 Medium RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2、把組織剪切成細小的碎片，越小越好。

3、取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

4、按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃ 裂解 15～30min。

5、步驟 3、4 亦可以采用如下過程：按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例， 加入含有 PMSF 的 Medium RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

6、10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

7、進行后續(xù)的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項：

1、去除貼壁細胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。

2、如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。

3、如果細胞量較多，必需分裝成 50～100 萬細胞/離心管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

4、如果組織樣品本身非常細小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈 Vortex 使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便， 不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

5、溶解  RIPA Lysis Buffer 時，應(yīng)盡量縮短溶解時間，避免有效成分失效。

6、裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA 等的復(fù)合物。在不檢測和基因組 DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如 NF-KB、p53 等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

7、細胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或 4℃進行。

有效期： 12  個月有效。

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