谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)

試劑盒說(shuō)明書(shū)

紫外分光光度法

注意：正是測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1 支，-20℃保存。

混合試劑配制：臨用前，在試劑二中加入試劑一40 mL，充分震蕩溶解后加入全部試劑三，混勻。（注意：必須現(xiàn)配現(xiàn)用，當(dāng)天使用完）

試劑四：液體×1 瓶，4℃保存。

產(chǎn)品說(shuō)明：

GSH-Px 是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與ROS反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，從而保護(hù)生物膜免受ROS 的損害，維持細(xì)胞的正常功能；而且具有保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力、拮抗有害金屬離子對(duì)機(jī)體的傷害和增加機(jī)體抗輻射等能力。

GSH-Px 催化H₂O₂氧化GSH，產(chǎn)生GSSG；谷胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH 還原GSSG，再生GSH，同時(shí)NADPH 氧化生成NADP⁺；NADPH 在340 nm有特征吸收峰，而NADP⁺沒(méi)有；通過(guò)測(cè)定340 nm光吸收減少速率來(lái)計(jì)算GSH-Px 活性。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）:試劑一體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取0.1g 組織，加入1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量10⁴個(gè)：試劑一體積（ml）500~1000:1 的比例,建議500 萬(wàn)細(xì)胞加入1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（率300w，超聲3 s，間隔7s，總時(shí)間3min）然后10000rpm，4℃，離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

二、測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 混合試劑在25℃或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱30min 以上。

3. 空白管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL 蒸餾水、800μL 預(yù)熱的混合試劑，100μL試劑四，迅速混勻后于340nm處測(cè)定第10 s和第190s的吸光值，分別記為A空1和A空2，△A 空白管= A空1﹣A空2。

4. 測(cè)定管：依次在1mL 石英比色皿中加入100μL 上清液、800μL 預(yù)熱的混合試劑，100μL試劑四，迅速混勻后于340nm 處測(cè)定第10 s和第190s 的吸光值，分別記為 A測(cè)1 和A測(cè)2，△A 測(cè)定管= A測(cè)1﹣A測(cè)2。

注意：空白管只需測(cè)定一次。

三、GSH-Px 活性計(jì)算：

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每 mg 蛋白每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (U/mg prot)=[(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（ Cpr×V 樣）÷T

=536×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每g 樣本每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (U/g)=[(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（W×V 樣÷V樣總）÷T

=536×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (U/10⁴ cell)=[(△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

=536×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量

(4). 按液體體積計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (U/ml)=[(△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷V 樣÷T

=536×(△A測(cè)定管-△A空白管)

ε:NADPH 摩爾消光系數(shù)6.22×10³L/mol/cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1000μL=0.001 L；

10⁶：1mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體，100μL =0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，3min。

注意事項(xiàng)：

1. 樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力。

2. 混合試劑和底物液須臨用前配制，配完后置于冰上，當(dāng)天使用完。

3. 測(cè)定過(guò)程操作須迅速。

4. 細(xì)胞中GSH-Px 活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300 萬(wàn)-500 萬(wàn)之間，細(xì)胞中GSH-Px 的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。

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