細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒說明書

Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit 

目錄號(hào)：K2575   

保存：  -20℃避光保存 

組分說明

Cat.No.                 K2575

KitSize                    50

DyeingBuffer              22.5ml

25×PropidiumIodide，PI     750 μl 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介 

    細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶染色(Propidiumstaining，即  PIstaining)方法進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡分析的檢測(cè)試劑盒。

碘化丙啶(Propidium，簡(jiǎn)稱PI)是一種雙鏈DNA 的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈 DNA 結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA 的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 DNA 含量測(cè)定，然后根據(jù)DNA 含量的分布情況，可以進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。碘化丙啶染色后，假設(shè)G0/G1 期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，那么含有雙份基因組DNA 的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的理論值為2，正在進(jìn)行DNA 復(fù)制的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1-2 之間。凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA*片段化(DNAfragmentation)導(dǎo)致部分基因組 DNA*片斷在染色過程中丟失，因此凋亡細(xì)胞碘化丙啶染色后呈現(xiàn)明顯的弱染，即熒光強(qiáng)度小于1，在流式檢測(cè)的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1 峰，即凋亡細(xì)胞峰。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮、核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，使細(xì)胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。在細(xì)胞凋亡的早期，細(xì)胞對(duì)前向角光散射的能力顯著降低，對(duì)側(cè)向光散射的能力增加或沒有變化。在細(xì)胞凋亡的晚期，前向和側(cè)向光散射的信號(hào)均降低。因此可通過流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞光散射的變化觀察細(xì)胞凋亡情況。

    本試劑盒通常應(yīng)用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細(xì)胞的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)。如果用于組織的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)，則必須把組織消化成單細(xì)胞狀態(tài)，才可以進(jìn)行檢測(cè)。

    本試劑盒每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)量可以為10-100 萬。

 注意事項(xiàng) 

 1.  本試劑盒需使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.  需自備PBS、95%乙醇和RNaseA。

3.  熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

4.  PI 對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。

5.  請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

                                                                                                                                               操作步驟

 1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

    a. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1毫升冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。再次加入1ml 冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞。

    b. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50 微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。再次加入1ml 冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞。

2. 細(xì)胞固定：

    取4 毫升冰浴預(yù)冷的95%乙醇，低速渦旋震蕩的同時(shí)加入 1 毫升細(xì)胞懸液，混勻后 4℃固定 2 小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。固定12-24 小時(shí)可能效果更佳。1000×g 左右離心 3-5 分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl 左右的乙醇，以避免吸走細(xì)胞。加入約5ml 冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

3.PI 染色液的配制：

    參考下表，根據(jù)待檢測(cè)樣品的數(shù)量配制適量的PI 染色液：

         

                           1 個(gè)樣品      6 個(gè)樣品      12 個(gè)樣品 

DyeingBuffer                 0.4ml    2.4ml    4.8ml 

25×PropidiumIodide，PI       15μl     90μl     180μl 

RNaseA(10mg/ml，自備)       1μl       6μl      12μl 

  注：配制好的PI 染色液短時(shí)間內(nèi)可以4℃保存，宜當(dāng)日使用。

4. 染色：

    每管細(xì)胞樣品中加入400μlPI 染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴 30 分鐘。隨后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24 小時(shí)內(nèi)完成流式檢測(cè)，*h能在當(dāng)日完成流式檢測(cè)。

5. 流式檢測(cè)和分析：

    用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA 含量分析和光散射分析。

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