血液RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)

RNApure Blood Kit

 Cat. No.   K0582

保存：室  溫

組分說(shuō)明

                                           Cat. No.                 K0582

                                            Kit Size                  50

                                      Buffer RBL（10×）             60 ml

                                           Buffer RL                  35 ml

                                         Buffer RW1                  40 ml

                                 Buffer RW2（concentrate）             11 ml

                                      RNase-Free Water                10 ml

                                    Shredder Spin Column               50

                                       Spin Column RM                50

                                  Collection Tube（1.5 ml）             50

                                   Collection Tube（2 ml）              100

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

    本試劑盒適用于從新鮮全血（用檸檬酸鹽、EDTA 或肝素等抗凝劑處理過(guò)的血液樣品）中提取總  RNA，可以處理多至1.5  ml 的全血，洗脫得到分子量大于 200 bp 的高純度 RNA，多個(gè)樣品可以在 1 小時(shí)內(nèi)同時(shí)完成。本產(chǎn)品無(wú)需 CsCl 純化的超離心步驟和 LiCl 或乙醇沉淀，不含有苯酚或氯仿等有毒溶劑，經(jīng)過(guò)純化的 RNA 有效去除血紅素、肝素等酶抑制劑和污染物，可直接用于各種分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，如 RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)

1.  預(yù)防 RNase 污染，應(yīng)注意以下幾方面：

1）  使用無(wú) RNase 的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

2）  玻璃器皿應(yīng)在使用前于 180℃高溫下干烤 4 小時(shí)，塑料器皿可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

3）  配制溶液應(yīng)使用無(wú) RNase 的水。

4）  操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要勤換手套。

2.  樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則影響提取 RNA 提取得率和質(zhì)量。樣品在 Buffer RL 中，可于-70℃保存一個(gè)月。

3.  使用前請(qǐng)檢查 Buffer RL 是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，可置于 56℃水浴重新溶解。Buffer RL 在使用前請(qǐng)加入β-巰基乙醇，

    至終濃度為 1%。如 1 ml Buffer RL 加 10 μl  β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個(gè)月。

4.  第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明先在 Buffer RW2 中加入無(wú)水乙醇。

5.  本試劑盒不能用于加入抗凝劑的冷凍血液樣本 RNA  的提取。

6.  10×Buffer RBL 需在使用前將溶液用無(wú) RNase 的水進(jìn)行 10 倍稀釋，稀釋后置于 2-8℃保存。

7.  若下游實(shí)驗(yàn)對(duì) DNA 非常敏感，建議用不含 RNase 的 DNase I（貨號(hào)：K2090A）對(duì) RNA 進(jìn)行處理。

自備試劑：  β-巰基乙醇、70%乙醇（用無(wú) RNase 的水配制）、無(wú)水乙醇  

操作步驟

1.  向0.5-1.5 ml 新鮮的抗凝全血樣本中，加入5倍體積的1×Buffer RBL（請(qǐng)于使用前用無(wú)RNase的水將10×Buffer RBL 稀釋10倍），輕輕渦旋或顛倒混勻。冰上孵育10-15分鐘，孵育過(guò)程中混勻兩次。

    注意：孵育過(guò)程中渾濁的懸液會(huì)變成透明，證明紅細(xì)胞被裂解，必要時(shí)可以把孵育時(shí)間延長(zhǎng)至20分鐘。

2.  4℃  2,100 rpm（~400×g）離心10分鐘，小心吸棄上清。

3.  向以上沉淀中加入2倍血液樣本體積的1×Buffer  RBL（請(qǐng)于使用前用無(wú)RNase的水將10×Buffer RBL稀釋10倍），輕輕渦旋，充分重懸沉淀。

4.  4℃  2,100 rpm離心10分鐘，小心并*吸棄上清。

    注意：此步一定要*去除上清否則影響裂解導(dǎo)致RNA產(chǎn)量下降。

5. 向沉淀中加入Buffer RL（使用前檢查是否已經(jīng)加入β-巰基乙醇），0.5-1.5 ml血液樣本加入600  μl Buffer RL，或小于0.5 ml  血液樣本加入350 μl Buffer RL，混勻。

6.將所得液體轉(zhuǎn)移到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的過(guò)濾柱（Shredder Spin Column）中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2分鐘，收集濾液，棄掉過(guò)濾柱。

7.向所得濾液中加入1倍體積（600  μl或350 μl）的70%乙醇（無(wú)RNase水配制），混勻。

    注意：加入乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

8.將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9.  向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1，12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    可選步驟：如果要進(jìn)行對(duì)微量DNA非常敏感的RNA實(shí)驗(yàn)，則用以下步驟替代步驟9。

    1）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    2）配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1 U/μl），混勻，  配制成終體積為80  μl 的DNase I混合液。

       注意:  以上體系為按照我公司產(chǎn)品DNase I （K2090A）反應(yīng)體系進(jìn)行配置，應(yīng)用其他公司產(chǎn)品請(qǐng)參考相應(yīng)說(shuō)明書(shū)。

    3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I混合液，20-30℃孵育15分鐘。

    4）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10.  向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

11.  重復(fù)步驟10。

12.  12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以*晾干。

    注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR  等）。

13.  將吸附柱置于一個(gè)新的無(wú)RNase離心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中間部位加入30-50 μl RNase-Free

    Water，室溫放置1分鐘，12,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）RNase-Free Wate體積不應(yīng)小于30  μl，體積過(guò)小影響回收率。

2）如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50  μl新的RNase-Free Water重復(fù)步驟13。

3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟13。

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