氯——#霉素

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物氯霉素將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗氯霉素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物氯霉素的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：   0.02ppb

u 孵育溫度：       25℃

u 孵育時間：       30min～30min～15min

u 樣本檢測下限

蛋類、牛奶（方法一） ···························· 0.04ppb

尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉··················· 0.02ppb

組織、肝臟、蜂蜜、牛奶（方法二）············· 0.01ppb

u 交叉反應率

氯+#霉素·     ······································· 100%

甲砜+#霉素   ······································ < 0.1%

氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%

u 樣本回收率

組織、肝臟 ································  85%±20%

蜂蜜、腸衣 ································  83%±25%

牛奶、飼料 ································  75%±23%

尿液、血清 ································  70%±18%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：乙酸乙酯、乙腈、亞硝基鐵氰+#化鈉、葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)、硫酸鋅、醋酸鈉、正己烷、醋酸

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

u 樣本前處理需配制：

配液1 C液（牛奶、奶粉樣本）：

10.7g 亞硝基鐵氰+#化鈉加去離子水100ml溶解。

配液2  D液（牛奶、奶粉樣本）：

28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解。

配液3 pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液（尿樣本）：稱2.4g醋酸鈉和1.2ml醋酸加去離子水500ml溶解混合。

配液4 乙腈-水溶液：

 V_乙腈：V_H2O＝84：16

配液5 樣本復溶液：

將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復溶液+1份去離子水，用于抗體的稀釋和樣本提取后的復溶)。

u 樣本處理：

（a）組織、肝臟樣本處理方法

1、 稱取均質后的樣本3±0.05g于50ml離心管中，先加入3ml去離子水混勻后再加入6ml乙酸乙酯，振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min；

2、 取出4ml上層液體在50-60℃氮氣流中吹干；

3、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml樣本復溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；去除上層有機相；

4、 取50 µl下層相用于分析。

樣本稀釋倍數:  0.5倍

（b）血清血漿處理方法

1、 取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩1min；靜置使水相與有機相分層或室溫4000r/min離心5min；

2、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮氣流50℃水浴中干燥；殘留物用1 ml樣本復溶液溶解，混合30s；

3、 取50 µl下層相用于分析。

樣本稀釋倍數:  1倍

（c） 尿液處理方法

1、 移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml混合；加40µl葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時（或過夜）；

2、 該溶液恢復至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合1min；室溫4000r/min離心10min，取出4ml上層液體在氮氣下50～60℃干燥；

3、 用1ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

4、 取50µl 用于分析。

樣本稀釋倍數:  1倍

（d）蜂蜜處理方法

1、 取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中，用4ml去離子水溶解；加入4ml乙酸乙酯振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min；

2、 移取2ml上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮氣流下干燥；用0.5ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

3、 取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數：  0.5倍  

檢測下限：0.025ppb      定量下限：0.1 ppb

注：我們推薦0.1 ppb為陽性樣本的cut off值。

（e）腸衣處理方法

1、 用均質器均質樣本；注：干樣本需剪碎（長度不超5mm）后再均質，濕樣本需用去離子水漂洗20min以上去除表面的鹽份，瀝干后再均質；

2、 稱1±0.05g均質后的樣本于50ml離心管中，加入10ml乙酸乙酯，振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min；

3、 取5ml上層液體（相當于0.5g的樣本）在氮氣流下50-60℃干燥；

4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml樣本復溶液振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；除上層有機相；

5、 取下層50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數：  1倍

（f）牛奶樣本處理方法一

1、 將牛奶樣本10℃4000r/min以上離心10min處理，吸除上層脂肪；然后取5ml去除脂肪奶樣至50ml離心管中，加入150µl C液出現沉淀，短暫振蕩后加入150µl D液混合；

2、 15℃4000r/min以上離心10min，移取上層液；用樣本復溶液以等體積稀釋上層液，混合30s；

3、 取50µl用于分析。

注：如果離心后仍然渾濁，再重復沉淀過程。

樣本稀釋倍數：2      

檢測下限：0.1ppb   定量下限：0.15ppb

（g）牛奶樣本處理方法二

1、 將牛奶樣本10℃4000r/min以上離心10min處理，吸除上層脂肪；然后取5ml去除脂肪奶樣至50ml離心管中，加入250µl C液和250µl D液*混合，4-12℃4000r/min以上離心10min。如無冷凍離心機，將樣本置冰箱中冷卻到8℃；

2、 轉移出2.2ml上層液（相當于2ml奶樣）至新的離心管中，加入4ml乙酸乙酯上振蕩2min；室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min ；

3、 吸取2ml乙酸乙酯上層液體（相當于1ml奶樣），50-60℃氮氣流下*干燥；用0.5ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

4、 取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數：0.5

檢測下限：0.025ppb    定量檢測限：0.05ppb

由于陰性樣本可能會產生背景干擾 （在某些

情況下干擾數值在標準2到3之間），所以推薦標準3作為陽性結果的CUT OFF判斷值。

（h）奶粉樣本處理方法

1、 稱2±0.05 g奶粉至50ml離心管中，加入10ml去離子水振蕩溶解；加入1ml C液和1ml D液*混合；4-12℃4000r/min以上離心10min。若無冷凍離心機，請預先將樣本冷卻到8℃；

2、 轉移出3.6ml上層液（相當于0.6g奶粉）至新的離心管中，加入6ml乙酸乙酯振蕩5min；室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min；

3、 吸取4ml乙酸乙酯上層液體（相當于0.4g奶粉），50-60℃氮氣流下*干燥；用0.4ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

4、 取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數：1    

檢測下限：0.05ppb     定量檢測限：0.15ppb

由于陰性樣本可能會產生背景干擾 （在某些情況下干擾數值在標準2到3之間），所以推薦標準3作為陽性結果的CUT OFF判斷值。

（i）蛋類處理方法

1、 稱取3±0.05 g均質的樣本，加入9ml乙腈-水溶液振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min；

2、 取3ml上層相與3ml去離子水水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯，混合1min，15℃4000r/min以上離心10min；取上層有機相置50-60℃下氮氣流吹干；

3、 加入1ml正己烷溶解殘留物后，用2ml樣本復溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；去除上層有機相；

4、 取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數：2    

檢測下限：0.1ppb     定量檢測限：0.3ppb

（j）飼料處理方法

1、 稱取2±0.05g均質過的飼料樣本，加入2ml去離子水，再加入6ml乙酸乙酯，充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min；

2、 取3ml上層有機相到試管中56℃下氮氣吹干；

3、 加入1ml正己烷溶解殘留物，用1ml樣本復溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；去除上層有機相；

4、 取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數：1

六、 酶標免疫分析程序:

u 測定前應須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、 將濃縮抗體用樣本復溶液11倍稀釋（1份抗體加入10份稀釋液，按需配制使用）

6、 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環境中反應30min。

7、 將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環境中反應30min。將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

9、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。

10、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含氯霉素量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.02ppb為1.816；0.06ppb為1.415；0.18ppb為0.74；0.54ppb為0.313；1.62ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.54ppb～1.62ppb；樣本2的濃度范圍是0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氯霉素實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以氯霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氯霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

八、 注意事項

1、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲藏條件和保質期

1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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