牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實時熒光PCR法）說明書
【產品名稱】
通用名稱：牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Contagious Bovine Pleuropneumonia (CBPP)Detecting Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】 25T/盒 ＆ 50T/盒
【預期用途】
本試劑盒利用改良分子信標實時熒光PCR原理，主要用于牛傳染性胸膜肺炎的定性篩查檢測。
【檢驗原理】
本試劑盒針對牛傳染性胸膜肺炎基因設計特異性引物和探針，在反應體系中含有牛傳染性胸膜肺炎 DNA模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | |
1 | 牛傳染性胸膜肺炎 PCR反應液 | 437.5μL×1管 | 875μL×1管 |
2 | 牛傳染性胸膜肺炎 混合酶液 | 62.5μL×1管 | 125μL×1管 |
3 | 牛傳染性胸膜肺炎 陽性對照 | 40μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 牛傳染性胸膜肺炎 陰性對照 | 40μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | DNA提取液 | 1.5 mL×1管 | 1.5 mL×2管 |
6 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為不含牛傳染性胸膜肺炎核酸的其它菌的混合物，陽性對照為牛傳染性胸膜肺炎經滅活處理的核酸提取物。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 動物組織樣本采集后取10mg～100mg用滅菌生理鹽500μL～1000μL水研磨，離心后取上懸液備用，避免標本間交叉污染。
2. 標本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-20℃～-80℃，長期保存不會影響本試劑盒檢測結果，但有可能影響培養法檢測結果的準確性。
3. 標本保存期間應避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
單反液配制表(每頭份) | PCR反應液 | 17.5 μL |
混合酶液（Taq酶+UNG酶） | 2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
(4) 蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管和試劑盒中的DNA提取液轉移至樣本處理區。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準備（樣本處理區）
用本公司病毒核酸提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。或按以下方法操作：
a.取試劑準備區傳遞過來的DNA提取液，2000 rpm 離心10 s后備用。
b.取樣本自然沉降后的上清液1 mL，加入到1.5 mL無菌離心管中，12000 rpm離心5 min后，吸干上清，保留沉淀。
c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL，將沉淀懸浮后100℃加熱處理5 min。
d.12000 rpm離心2 min，取上清用于PCR檢測。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴增區）
（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集牛傳染性胸膜肺炎 熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環數 |
UNG處理 | 50℃：2分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【陽性判斷值或者參考區間】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。
2.標本結果判定：
（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結果的解釋】
通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 |
FAM | |
陰性（－） | 標本中未檢出牛傳染性胸膜肺炎 |
陽性（＋） | 標本中檢測出牛傳染性胸膜肺炎 |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最+#低檢出*可能會發生假陰性的結果。
2. 本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結果應進一步使用培養法進行確診。
【產品性能指標】 產品的最+#低檢出限為102CFU，產品CV值≤5%。
【注意事項】
1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進行操作，各區實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區應該配有紫外線殺菌裝置。
2. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
3. 為保證試劑不受標本污染，必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應液保存于試劑準備區。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。
5. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉移至標本準備區，并單獨存放。
6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
7. 儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。
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