2×GC-rich PCR  MasterMix（無染料）說明書

貨號：K0658

保存條件：-20℃長期保存。如需頻繁使用，可存放于2-8℃，盡量避免反復凍融。

組分說明

              Cat. No.                                  K0658

              Kit Size                                    1 ml

              2×GC-rich PCR MasterMix（無染料）          1 ml

              RNase-Free Water                            1 ml

              注意：2×GC-rich PCR MasterMix含有Es Taq DNA Polymerase,

              2×Es Taq PCR Buffer, 3 mM MgCl2和400  µM dNTP mix。

產品簡介

　　本品是由Es Taq  DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg、dNTPs以及PCR穩定劑

和增強劑組成的預混體系，濃度為 2×。預配好的PCR混合液使操作更加2+ 簡單快捷，可最大限度地減少人為誤差和污染。經過優化的緩沖液配方使酶的作用發揮最大功效，實現對復雜模板的高保真、高效率擴增，d創的MasterMix配方使整個反應體系非常穩定，重復性好。本品不含染料， PCR程序結束后可根據需要加入適量上樣緩沖液后進行電泳操作。擴增得到的PCR產物3′端附有一個“A"堿基，因此可直接用于T/A克隆。主要適用于對保真性要求較高的PCR反應和結構復雜的模板如GC含量高，有二級結構等的擴增，對簡單模板有效擴增的片段可達20 kb，對復雜模板可達10 kb。

質量控制

　　經檢驗無外源核酸酶活性； PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地擴增多種基

因組中的單拷貝基因；2-8℃存放三個月，活性無明顯改變。

                本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途

    使用方法

    以下舉例為常規PCR反應體系和反應條件，實際操作中應根據模板、引物結構和目的

    片段大小不同進行相應的改進和優化。

    1. PCR反應體系

試劑                          50 μl反應體系        終濃度

2×GC-rich PCR MasterMix         25 μl                1×

Forward Primer，10 µM            2 μl               0.4 μM

Reverse Primer，10 µM            2 μl                        0.4 μM

Template DNA                    2  μl              <1 μg/reaction

RNase-Free Water               up to 50 μl

       注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系。

2. PCR反應條件

步驟                 溫度              時間

預變性               94℃             2 min

變性                 94℃             30 s

退火                55-65℃           30 s     25-35個循環

延伸                 72℃             30 s

終延伸               72℃             2 min

       注意：1）一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優化反應條件。

       2）延伸時間應根據所擴增片段大小設定，Es Taq DNA Polymerase的擴增效率為1 kb/30 s。

       3）可根據擴增產物的下游應用設定循環數。如果循環次數太少，擴增量不足；如果循環次數太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以在保證產物得率的前提下應盡量減少循環次數。

    3.結果檢測：本產品不含染料，反應結束后取5  µl反應產物加入適量上樣緩沖液后進行電泳檢測結果。

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