siRNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書

貨號(hào)：YJ0871

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組分說(shuō)明

   Catalog no.                YJ0871           YJ0871A

   Kit Size                  0.5 ml             1 ml

siRNA Transfection Reagent         0.5 ml           1 ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

         siRNAFect 是一種的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。適用于多種細(xì)胞的 siRNA  轉(zhuǎn)染，其原理為帶正電的脂質(zhì)體通過(guò)靜電作用結(jié)合到 RNA  的磷酸骨架上形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加到細(xì)胞上可以與帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面結(jié)合即可通過(guò)胞吞作用將 siRNA 導(dǎo)入細(xì)胞中。主要應(yīng)用于 RNAi  研究，基因表達(dá)和基因功能研究等。

注意事項(xiàng)

 1.  轉(zhuǎn)染試劑使用前請(qǐng)先震蕩搖勻。

 2.  轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞密度有很大關(guān)系，不同實(shí)驗(yàn)間應(yīng)應(yīng)保持一個(gè)基本的傳代步驟，且應(yīng)確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)滿或處于靜止期。一般貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染的*細(xì)胞密度是70-90%，懸浮細(xì)胞的*細(xì)胞密度為2-4x106 細(xì)胞/ml，用于轉(zhuǎn)染的*細(xì) 胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或用途而異。  

使用方法

    以下操作步驟以12孔板為例，其他孔板按照表1中所列用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

  1.  在12孔板的每孔中加入1  ml正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基（根據(jù)需要可加入適量的血清），接種1-3x10  細(xì)胞。在37℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞濃度至70-90%。根據(jù)細(xì)胞類型的不同，這一過(guò)程通常需要18-24小時(shí)不等。由于轉(zhuǎn)染效率培養(yǎng)條件及其敏感，所以應(yīng)在不同的實(shí)驗(yàn)間建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的傳代流程。

  2.  將20 pmol iRNA溶于終體積為50 μl的無(wú)血清，無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中，渦旋5秒或者用槍盡量吹打均勻。

  3.  將2.6  μl轉(zhuǎn)染試劑稀釋到終體積為50 μl的無(wú)血清，無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中，渦旋10秒。

      注意：溶解過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)白色混濁，但不影響轉(zhuǎn)染效率。

  4． 將稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑加入到核酸溶液中（注意順序一定不能顛倒），渦旋1秒，室溫孵育15分鐘，使轉(zhuǎn)染試劑與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物（此步驟盡量不要超過(guò)20分鐘，否則會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率）。

  5.  向穩(wěn)定復(fù)合物中加入900  μl帶血清的培養(yǎng)基，用槍輕輕吹打均勻。

  6.  吸去培養(yǎng)板中原有的培養(yǎng)基，加入步驟5中混合好的培養(yǎng)基。在37℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞24-72小時(shí)。

  7.  根據(jù)細(xì)胞類型和啟動(dòng)子活性不同，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)分析細(xì)胞抽提物，檢測(cè)報(bào)告基因活性。

  8.  對(duì)于穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，在轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，按1：10的比例在細(xì)胞中加入選擇培養(yǎng)基對(duì)已轉(zhuǎn)染的報(bào)告基因進(jìn)行篩選。

                                表1：  對(duì)不同大小的細(xì)胞培養(yǎng)皿，試劑的用量

培養(yǎng)板   每孔表面積  鋪板培養(yǎng)基體積  siRNA和稀釋終體積（μl）siRNA轉(zhuǎn)染試劑體積

96孔         0.3        100  μl        3 pmol至10  μl     0.4  μl至10 μl

24孔          2         500  μl        10 pmol至20  μl       1.3  μl至20 μl

 12孔          4        1 ml           20 pmol至50  μl      2.6  μl至50 μl

35 mm        10         2 ml          50 pmol至100  μl       6.6  μl至100 μl

 6孔         10         2 ml          50 pmol至100  μl     6.6  μl至100 μl

  60 mm       20        5 ml     100 pmol至200  μl       13.3 μl至200 μl

 10 cm        60        15 ml      300 pmol至500  μl       40 μl至500 μl