HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒說明書

HiFi-MMLV One Step RT-PCR Kit

HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒

目錄號：YJ0745

保存條件：-20℃保存。

組分說明

           Cat. No.                                   YJ0745

           Kit Size                                      100

           HiFi-MMLV OneStep RT-    PCR EnzymeMix       50 μl

           2×OneStep RT-PCR Buffer                      1.4 ml

           RNase-Free Water                             1 ml

            本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡介

　　本試劑盒是專為一步法RT-PCR實驗研制，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同一反應(yīng)體系中進行，

反應(yīng)過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗

效率。本試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動   DNA聚合酶，同時包含適用于逆轉(zhuǎn)錄和

PCR擴增的反應(yīng)緩沖液和實驗中所必需的反應(yīng)組分。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性

缺失，減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RNA的降解。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性強，可獲得高產(chǎn)

量的cDNA。PCR反應(yīng)使用的快速熱啟動DNA聚合酶具有擴增效率高、延伸速度快的優(yōu)

良性能。*的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時發(fā)揮zui大功效。使用本試劑盒擴增得

到的目的產(chǎn)物3′端附有一個″A″堿基，可直接用于T/A克隆。

注意事項

1．在操作過程中應(yīng)避免RNase污染，防止RNA降解或?qū)嶒炛械慕徊嫖廴荆ㄗh在專門

   的區(qū)域進行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)

   常更換手套。

2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應(yīng)使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應(yīng)使用 0.1%的DEPC

   處理后進行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應(yīng)盡快放回-20℃，避免反復(fù)凍融。

4．本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據(jù)具體實驗來選擇，引物設(shè)計的好

   壞直接影響到RT-PCR  反應(yīng)的結(jié)果，設(shè)計引物時需考慮GC含量，引物長度，引物

   位置，PCR產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)等因素，建議采用專業(yè)的引物設(shè)計軟件來設(shè)計。

使用方法

1．將RNA模板、引物、  OneStep RT-PCR  Buffer、OneStep  RT-PCR  EnzymeMix

   和RNase-Free  Water溶解并置于冰上備用。

2．根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系：

 試劑                                       25 μl反應(yīng)體系         終濃度

2×One Step RT-PCR Buffer                      12.5 μl          1×

Forward Primer，10 μM                            1 μl         0.4 μM

Reverse Primer，10 μM                            1 μl         0.4 μM

HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix             0.5 μl

RNA Template                                   X μl        10 pg –1 μg

RNase-Free water                            up to 25 μl

   注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。

4．將熱循環(huán)儀預(yù)熱到45℃，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，進行RT-PCR反應(yīng)。

   反應(yīng)條件：

                  步驟            溫度        時間

                 反轉(zhuǎn)錄            45℃      30 min

               PCR預(yù)變性           95℃       2 min

                  變性            94℃       30 s

                  退火          55-65℃      30 s    30-40個循環(huán)

                  延伸            72℃       30 s

                 終延伸            72℃       5 min

   注意：1）一般PCR實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時間一般為20-30秒，無法得到理想的擴增效率時，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。

   2）延伸時間根據(jù)擴增的片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品中包含的DNA Polymerase擴增效率為1 kb/30s。

   3）可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；循環(huán)次數(shù)多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

5．反應(yīng)結(jié)束后取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進行電泳檢測結(jié)果。

     相關(guān)產(chǎn)品信息

目錄號               產(chǎn)品名稱                                        產(chǎn)品特點

YJ0580   TRIzon總RNA提取試劑                       適用范圍廣的RNA提取試劑

YJ0581 超純RNA提取試劑盒

兼具有適用范圍廣和純度高特點的RNA提取試劑

YJ0597 超純RNA提取試劑盒（含DnaseI）    靈敏度高，可識別pg級別的模板。與RNA親和力強，

YJ0741   SuperRT cDNA*鏈合成試劑盒

                                                     能夠通讀GC含量高，二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板。

YJ0744   HiFi-MMLV cDNA*鏈合成試劑盒獲得cDNA產(chǎn)物

SuperQuickRT  cDNA*鏈合成試逆轉(zhuǎn)錄（針對于熒光定量PCR

劑盒(For Real-time PCR)）

YJ2381                       僅需15分鐘，即可完成熒光定量PCR所需的cDNA 

                SuperQuickRT MasterMix          即用型逆轉(zhuǎn)錄mix，只需加入RNA和水即可反應(yīng)。僅

YJ2391 

                (for Real-Time PCR)                  需15分鐘，即可完成熒光定量PCR所需的cDNA 

YJ0688   Es Taq DNA Polymerase 

                                           兼具高擴增效率和高保真性的PCR產(chǎn)品

YJ0690   Es Taq MasterMix 

YJ0957   UltraSYBR Mixture                      熒光定量PCR—SYBR Green法

YJ0956   UltraSYBR Mixture（With ROX）            特異性強、Ct值低、定量更準(zhǔn)確