組織細胞內抗原的固定

組織細胞內抗原的固定是免疫酶標和非標記免疫酶組織化學方法中的重要環節。經過固定，可以達到如下目的：1.標本在玻片上的吸著力增加；2.標本所含的類脂和蠟質等成分可以除去，從而有利于抗原與酶標記抗體的結合；3.標本的保存時間可以增長，組織切片固定后，在－20℃，可以存放一年以上而不改變免疫酶技術的染色；組織內有關抗原不同，則所用固定劑與固定方法也隨之改變。

   丙酮和乙醇是常用的兩種固定劑。但對于許多病毒與細菌的定位研究，選擇丙酮和四氯化化碳作為固定劑是zui合適的；對于可溶性蛋白抗原的定位，常用乙醇；對于多糖，則用8%－10%福爾馬林，而不用乙醇與丙酮等有機溶劑。

   對于那些在表面覆蓋蛋白衣膜的抗原，還常用胰蛋白酶、黏蛋白酶、透明質酸酶以及受體破壞酶進行處理。有人報道，苦味酸－甲醛固定液應用于肝組織內甲種胎兒蛋白酶標定位能獲得滿意結果。

   對于植物病毒材料的固定，丙酮用得zui多，乙醇次之。因為丙酮對病毒的抗原性損害為zui小，但對于那些不穩定的病毒，則應避免固定。

   在應用免疫酶技術時，固定處理對酶的活性的影響也得心中有數。許多固定劑對抗原的活性都 會有所損害，例如，福爾馬林對蛋白抗原的固定造成抗原性的破壞非常明顯。因此，對福爾馬林的使用必須嚴格控制濃度，一般使用的福爾馬林濃度為10%，盡管如此，對抗原的抗原性還是有損害，所以必須進行抗原修復。

   另外，對于堿性磷酸酶，在4℃下，丙酮固定一晝夜，能喪失30%的活性，如用丙酮固定后包埋，則喪失70%的活性；在4℃下，福爾馬林固定2－4h，則喪失25%的活性。

   固定條件對標本的固定效果作用較大。

   固定劑濃度：丙酮zui常用的是100%；乙醇zui常用95%，但是70%乙醇的固定力為zui強；福爾馬林常用10%。

   固定的溫度：一般而言，固定作用隨溫度升高而加強，室溫是zui常用的。固定溫度可以－70－30℃。應根據不同的抗原使用不同的溫度，麻疹病毒應在－20－40℃用丙酮固定30min，而酶可以37℃用乙醇固定15min.

   固定液的pH：一般以所用固定劑的pH為準，但若以酶去除某些抗原表面的蛋白衣膜時，應根據所用酶的性質調節pH。

   固定時的干濕度：干濕度一般情況下不需考慮，但某些材料在固定時受干濕度影響很大。丙酮對Hela 細胞中的灰質炎病毒固定，在室溫干燥的情況下，N抗原就轉變為H抗原；而在－20℃不干燥的情況下，N抗原保持不變。

   固定的時間：有長有短，一般在室溫下，固定15min左右，低溫下固定30min.如僅為了使材料不脫落為了減輕未處理的新鮮冰凍切片出現的空泡，則可用丙酮、乙醇和甲醛作短時間處理。

   固定后的沖洗：固定后的材料常用中性磷酸緩沖液反復沖洗，以免在固定過程中可能彌散出來的物質覆蓋表面。

   固定標本的保存：標本材料經固定后，要立即使用于免疫酶技術中，不要久貯。如實在要保存，應置于冰箱（4℃）中，在干燥的情況下24h內抗原性損失不大。在－20℃下，冰凍切片或涂片可保存1周到1個月，石蠟切片可保存數月以上。在－20℃下保存時，為了防止形成過多的冰結晶并發生組織細胞的變化，應將切片浸入聚乙烯醇甘油溶液中，讓其在－20℃下形成固態保護膜，然后在免疫酶染色前用手指加溫，用生理鹽水輕輕洗去，每次5min,共洗3次。這樣保存的標本，污染增多。某些干燥標本（例如組織內阿米巴抗原、組織自身抗原）貯于辛烷中可長期保存（－30℃），并且幾乎無污染。

   固定的程序很簡單，將固定劑用吸管加到標本上去，或將標本置于玻片架上浸入固定劑溶液中，固定后立即用磷酸緩沖液沖洗，然后在空氣中晾干或風扇吹干。