基于生物質(zhì)譜的蛋白鑒定、定量、翻譯后修飾分析

實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，在質(zhì)譜儀中肽段混合物電離形成帶電離子,質(zhì)譜分析器的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(即質(zhì)荷比, M/Z) 的肽段離子分離開來,經(jīng)過檢測(cè)器收集分離的離子,確定每個(gè)離子的MZ值。經(jīng)過質(zhì)量分析器可分析出每個(gè)肽段的MIZ.得到蛋白質(zhì)所有肽段的M/Z圖譜，即蛋白質(zhì)的--級(jí)質(zhì)譜峰圖。離子選擇裝置自動(dòng)選取強(qiáng)度較大肽段離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，輸出選取肽段的二級(jí)質(zhì)譜峰圖，通過和理論.上蛋白質(zhì)經(jīng)過胰蛋白酶消化后產(chǎn)生的--級(jí)質(zhì)譜峰圖和二級(jí)質(zhì)譜峰圖進(jìn)行比對(duì)而鑒定蛋白質(zhì)。根據(jù)離子源的不同，目前用于蛋白分析的主流質(zhì)譜技術(shù)主要有電噴霧離子化質(zhì)譜(ESHMS) 和基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(ML ADHMS)。質(zhì)量分析器主要有四極桿分析器(QE).離 子阱分析器(Orbitrap)、飛行時(shí)間分析器 (MLADI-TOF) 。

生物質(zhì)譜在蛋白分析方面的應(yīng)用

1.蛋白鑒定:由于各種蛋白質(zhì)的氨基酸序列(--級(jí)結(jié)構(gòu))不同，蛋白質(zhì)被酶解后產(chǎn)生的肽段序列也各異，肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具有特征性，稱為肽質(zhì)量指紋譜(peptide mass fingerprint, PMF) ，可用于蛋白質(zhì)的鑒定。

2.蛋白定量:基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記法，如SIL AC. QconCAT. iTRAQ等;基于質(zhì)譜歸--化的非標(biāo)定量法，如蛋白豐度指數(shù)法PAI、多肽匹配數(shù)、譜圖計(jì)數(shù)、碎片離子峰強(qiáng)度(iBAQ) , SWATH等。

3.蛋白翻譯后修飾:根據(jù)特定修飾基團(tuán)的圖譜特點(diǎn)進(jìn)行翻譯后修飾的鑒定和定位，包括磷酸化、糖基化、巰基和二硫鍵定

位、乙酰化、泛素化等。

實(shí)驗(yàn)步驟

①組織或細(xì)胞蛋白提取;

②蛋白酶消化，將蛋白樣品制備成多肽;

③多肽抽提和質(zhì)譜儀分析，產(chǎn)生肽段質(zhì)荷比和肽離子質(zhì)量;

④搜庫(kù)、打分、輸出排序;

⑤搜庫(kù)后分析，蛋白鑒定、定量或翻譯后修飾分析。

實(shí)驗(yàn)完成周期及交付標(biāo)準(zhǔn)

1.實(shí)驗(yàn)完成周期10~30天,

2.交付標(biāo)準(zhǔn):

①主要儀器、試劑和實(shí)驗(yàn)方法:

②包含protein ID. gene symbol. spectrum count. u-peptide. z-score.、 coverage等信息的蛋白鑒定列表;

③所有肽段信息表;

④質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)(raw data)。

需確認(rèn)的信息

1.樣品:①如果樣品為蛋白質(zhì)溶液，蛋白質(zhì)總量≥300mg ;

②.如果是組織樣品，樣品總量≥0.1g;如果是細(xì)胞樣品，細(xì)胞數(shù)量≥107個(gè);

③、如果是體液樣品，血清≥200ml,腦脊液≥200ml,尿液≥1ml, 淚液≥1ml;

2.樣品采集過程中使用到塑料制品時(shí)，盡量使用無色產(chǎn)品，以減少塑料制品中雜質(zhì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的影響;

3.確認(rèn)樣品所屬種屬、分析需求。

文獻(xiàn)參考

[1]Liu Q, et al. In-depth proteomic characterization of endogenous nuclear receptors in mouse liver. Mol Cell Proteomics.2013;12(2):473-84.

[2]Ruprecht B, et al. MALDI-TOF and nESI Orbitrap MS/MS identify orthogonal parts of the phosphoproteome.

Proteomics.2016;16(10);:1447-56.

[3]Kobayashi D, et al. Identification of a specific translational machinery via TCTP-EF1A2 interaction regulating NF1-associated tumor growth by afinity purification and data-independent mass spectrometry acquisition (AP-DIASWATH).Mol Cell Proteomics.2018 Oct 31. PubMed PMID: 30381327.

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