高純度質粒小量快速提取試劑盒

HighPure Rapid Mini Plasmid Kit

保存條件：本試劑盒在室溫儲存 18 個月不影響使用效果。

產品介紹：

本試劑盒采用改進 SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低

pH 值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫。

產品特點：

1. 離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。

2. 獨有的去蛋白液配方，可以高效去除殘留的核酸酶，即使是核酸酶含量豐富的菌株如 JM 系列、HB101 也可以輕松去除。有效防止了質粒被核酸酶降解。

• 快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯防仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質粒產量高、純度好， 可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

注意事項：

• *次使用時，將試劑盒所帶的全部 RNase A 加入溶液 P1 后（終濃度 100ug/ml） 置于 2-8℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的質粒可能會有微量 RNA 殘留，在溶液 P1 中補加 RNase A 即可。
• 環境溫度低時溶液 P2 中 SDS 可能會析出渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾 min， 即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

3. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH 值變化。

• 溶液 P3 和去蛋白液 PE 中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
• 提取質粒的量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。一般高拷貝質粒，建議接種單菌落于 1.5-4.5ml 加合適抗生素的 LB 培養基， 過夜培養 14-16 個小時，可提取出多達 20µg 的純凈質粒。如果所提質粒為低拷貝質粒或大于 10kb 的大質粒，應適當加大菌體使用量，使用 5-10ml 過夜培養物，同時按比例增加 P1、P2、P3 的用量，其它步驟相同。
• 得到的質粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD₂₆₀ 值為 1 相當于大約 50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為 2 條或者多條 DNA 條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 90%。
• 洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫， 但應該確保 pH 大于 7.5，pH 過低影響洗脫效率。用水洗脫質粒應該保存在－20℃。質粒DNA 如果需要長期保存，可以用 TE 緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA， pH 8.0），但是 EDTA 可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

自備試劑：無水乙醇操作步驟：

提示：

 *次使用前請先在漂洗液 WB 和去蛋白液 PE 瓶中加入量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

 將 RNase A 全部加入溶液 P1 中，混勻，每次使用后置于 2-8℃保存。

將溶液 P3 放在冰上預冷，可以提高產量。

1. 向吸附柱AC 中（吸附柱放入收集管中）加 500μl 的平衡液BL，12,000rpm  離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

2. 取 1.5-4.5ml 過夜培養的菌液，12,000rpm 離心 30 sec，盡可能的倒干上清，收集菌體。收集超過1.5 ml 菌液， 可以離心棄上清后，在同一個 1.5ml 管內加入更多的菌液，重復步驟 1，直到收集到足夠的菌體。

3. 用 250μl 溶液 P1 重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至*懸浮。

4. 加 250μl 的溶液 P2，溫和地上下翻轉 4 -7 次使菌體充分裂解。

5. 加 350μl 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉 4 -7 次，充分混勻時會出現白色絮狀沉淀，

13,000rpm 離心 10 min，小心取上清。加入溶液 P3 后應該立即混勻，以免產生 SDS的局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清

6. 將上一步所得上清加入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm 離心 30-60sec，倒掉收集管中的廢液可選步驟:加入 500μl 去蛋白液 PE，12,000rpm 離心 30-60sec，棄廢液。此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質，如所用菌株為 JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株，核酸酶含量豐富，應加此步驟；如所用菌株為 XL-1 Blue 和 DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，則可略過此步驟。

7. 加入 500μl 漂洗液 WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm  離心 30 sec，棄掉廢液。

8. 重復步驟 7。

9. 將吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 離心 2 min，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。                                             

10.取出吸附柱 AC，放入一個干凈的離心管中，室溫放置幾分鐘。

11.在吸附膜的中間部位加 50μl-100μl 洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置 2 min，12,000rpm  離心 1 min。如果需要較多量質粒，

可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心 1 min。洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于 50μl， 體積過小降低質粒洗脫效率，減少質粒產量。若用ddH₂O 做洗脫液，應保證其 pH 值在 7.0-8.5 范圍內，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率。