磺胺多殘留快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物磺胺類藥物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物磺胺類藥物的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物磺胺類藥物的含量。

二、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：  0.4ppb

u 孵育溫度： 25℃

u 孵育時間： 30min～15min

• 樣本檢測下限

組 織（高 檢 測 限 方 法）             0.4 ppb

蜂 蜜                              0.4 ppb

血 清 、尿 液                           1.6 ppb

磺胺間（六）甲氧嘧啶（SMM）      181.8% 

磺胺甲噁唑（SMZ）       86.6%

磺胺異噁唑（SIZ）                76.5%

磺胺噻唑（ST）                   103.3%

磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDM′）            132.1%

磺胺多辛（SDM2）                    144.7%

酞酰磺噻唑（PST）                     73.9%

磺胺苯酰（SML）                      104%

磺胺咪(SG)                                    0.1%

由反應(yīng)交叉率可以得出：該試劑盒可用于磺胺多種殘留物的檢測，*國家磺胺類多殘留種類檢測的要求。

• 樣本回收率

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、刻度移液管

微量移液器：單道 20µl～200µl、單道 100µl～1000µl、多道 30～300 µl

試 劑：乙酸乙酯、Na2HPO4·12H2O、乙qing、

NaH2PO4·2H2O、K2HPO4·3H2O、二氯甲wan、正己烷

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

u 樣本前處理需配制：

配液 1 0.1M K₂HPO₄ 溶液稱取 11.4g  K₂HPO₄·3H₂O 用去離子水500ml 溶解。配液 2 0.02M PB 緩沖液稱取 5.16g Na2HPO4·12H2O 和 0.87gNaH₂PO₄·2H₂O 加去離子水 1L 溶解。

配液 3 乙qing-二氯甲*烷混合液

V _乙qing-V _{二氯甲*烷}  = 1 : 4

配液 4 樣本復(fù)溶液：

將 20X 濃縮復(fù)溶液用去離子水 1：19 稀釋。

• 樣本處理：

（a）組織高檢測限處理方法一

1、稱 2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于 50ml 離心管中；加入 8ml 乙qing-二氯甲*烷混合液，振蕩 2min， 4000r/min 以上，15℃離心 10min；

2、取 4ml 清澈有機相至干燥容器中，50-60℃氮氣或空氣吹干；3、用 1ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷 1ml。混合 30s，4000r/min 以上 15℃離心

5min；去除上層正己烷；4、取下層 50µl 液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  1 倍

（b）組織高檢測限處理方法二

1、稱取 3±0.05g 勻漿物置離心管中，先加入 3ml0.02M PB 緩沖液充分振蕩混勻，再加入 4ml 乙酸乙酯和 2ml 乙qing，充分振蕩 10min，于 15℃ 4000r/min 以上速度離心 10min；

2、移取 2ml 上層液體（約相當(dāng)于 1g 的樣本）在50-60℃氮氣或空氣吹干；

3、加入 1ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加入 1ml 樣本復(fù)溶液強烈振蕩 1min，室溫 4000r/min，離心 5min，除去上層正己烷；

4、取下層 50µl 液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  1 倍

（c）血清處理方法

1、將血樣本于室溫放置 30min，于 10℃，4000r/min以上離心 10min，分離出血清或過濾血清；

2、取 1ml 血清，加入 3ml 0.02 M PB 緩沖液混合，

混合 30s；3、取 50µl 液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  4 倍

（d）蜂蜜處理方法

1、稱取 2±0.05g 蜂蜜樣本于 50ml 離心管中，加入2ml 0.1M K₂HPO₄ 溶液，渦旋震蕩 2min；

2、再加入8ml 乙酸乙脂，渦旋振蕩3min，4000r/min以上 15℃離心 10min；3、取 4ml 上層液體于 56℃下氮氣吹干，加 1ml 樣本復(fù)溶液復(fù)溶，渦旋震蕩 1min；4、取 50µl 液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  1 倍

（e）尿液處理方法

1、用 3ml0.02 M PB 緩沖液與 1ml 經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合 30s；2、取 50µl 液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  4 倍

（f）牛奶處理方法

1、取 1ml 牛奶樣本用 0.02 M PB 緩沖液按 1︰19（v/v）稀釋（即 20µl 牛奶+380µl 0.02 M PB 緩沖液），混合 30s；2、取 50µl 液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  20 倍

六、酶標(biāo)免疫分析程序:

• 測定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于 2-8℃。

3、配液：將 40ml 20X 濃縮洗滌液用去離子水稀釋至 800ml。

4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物 50µl/孔，然后再加入抗體工作液 50µl/ 孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。

6、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色 15min。

8、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：

0ppb 為 2.243； 0.4ppb 為 1.816；0.8ppb 為 1.415； 1.6ppb 為 0.74；3.2ppb 為 0.313；6.4ppb 為 0.155。

則樣本 1 的濃度范圍是 3.2ppb～6.4ppb；樣本 2 的濃度范圍是 0.8ppb～1.6ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以 100%，即

百分吸光度值（%）＝  ^B ×100%

B₀

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B₀—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以磺胺類藥物

標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

3、單項磺胺類檢測結(jié)果計算

將按照試劑盒計算出來的結(jié)果乘以相應(yīng)的交叉反應(yīng)率即為磺胺單項的檢測值。

八、 注意事項

1、室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、該試劑盒理想反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、儲藏條件：試劑盒于 2～8℃保存，不要冷凍。

2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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