多克隆抗體制備服務(wù)

多抗一般制備流程:*抗原的準(zhǔn)備- +兔子的免疫-→ 效價檢測和終放- +抗體親和純化- +抗體的濃縮和保存。

具體實驗步驟如下:

1.兔子的準(zhǔn)備

挑選健康的6周大小的新西蘭大白兔兩只(約2Kg) ，使其適應(yīng)新的生活環(huán)境，至少穩(wěn)定幾天再進(jìn)行*取血、預(yù)采血(作陰性參照用)

1.1將兔子小心的放入固定的架中，使兔子平靜;

1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可見(也可不剃);

1.3如果有必要，可用小棉球沾酒精涂抹血管部位使血管膨脹;

1.4用注射器從耳靜脈抽取約10ml血液(約5ml血清);

1.5小心抽出針頭，適當(dāng)按壓傷口以免流血，然后用酒精棉球消毒傷口;

1.6將收集的血液置于37 C滅活30min,后置于4" C過夜使其凝結(jié)釋放血清;

1.7將凝結(jié)好的血液在10000r / min離心10min; h.收集 上清，即為血清。

兔子的免疫

2.1注射兩只兔子的抗原為1ml,抗原緩沖溶液必須不含對兔子有害的化學(xué)試劑每只兔子初次免疫400ug抗原比較適合，也可適當(dāng)減少以獲得更好的結(jié)果，后續(xù)免疫每次為100ug即可。

2.2將1m的佛氏*佐劑與準(zhǔn)備好的1m抗原充分混勻，呈乳白色; .

2.3小心從籠中取出兔子,織兔子免疫4個部位(背部和大腿根部均可)，每個部位250ul,針頭呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留數(shù)秒以防止抗原外流。

2.4兔疫周期為20天，免疫完后7-10天取血(包括中途測試取血和終放血)，總共免疫4-5次。

3.效價檢測

3.1 2個參照陰性參照為預(yù)取血血清，均以1抗起始濃度稀釋(封閉稀釋液);陽性參照為以前

陽性血清

3.2于96孔板中每孔滴加100ul, 1ug/m抗原，于49C過夜， 也可以37°C孵育2小時。

3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200u的封閉液， 49C過夜或者379C孵育2小時。

3.4倒去封閉液，在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體，用洗滌液洗板三次每次盡量拍干殘留液體，若要放置一段時間, 37°C烘干并用封口袋封好于20°C存放。

3.5取包被好的96孔板，第---孔加入陰性 參照液100ul,第二孔加入陽性參照液100ul,第三孔加入1:500的待測抗血清，后續(xù)各孔在此基礎(chǔ)上倍比稀釋,于37°C孵育1 小時。

3.6倒掉液體，用洗滌液洗板三次,拍干。每孔加入100u的HRP標(biāo)記的小鼠抗兔lgG (1: 2000稀釋)，于37°C孵育45分鐘。

3.7倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100u的TMB底物(Sigma 單組份TMB ) 37°C孵育5-20分 鐘(根據(jù)顏色深淺來決定顯色的時間)。

3.8每孔加入50u的終止液(2N H2SO4)， 在酶標(biāo)儀上讀取波長450nm處的吸光值。

抗體效價檢測達(dá)到100萬以上后可以對兔子進(jìn)行終放血。

抗體的純化

4.抗體的親和--親和柱的制備

4.1 稱取1mg CNBr- Sepherose 4B的瓊脂糖凝膠加入2mmol/ L的鹽酸中，4" C過夜使其充分溶漲，可獲得3m溶漲膠。

4.2將凝膠轉(zhuǎn)移入純化柱中，用約20ml 2mmol / L的鹽酸洗介質(zhì)3次。

4.3用偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)- -次，因為活化基團(tuán)在偶聯(lián)緩沖液PH值下易水解，所以此步驟在幾分鐘內(nèi)完成。

4.4將溶解在5ml偶聯(lián)緩沖液中的5-10mg的抗原加入凝膠中

4.5室溫下輕輕混合搖動2-4小時，或4" C過夜,如需測定結(jié)合效率此步驟結(jié)束后取少量溶液待測。用20ml的偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一-次。

4.6加入15m1 1% BSA溶液室溫下孵育2小時或4" C過夜。

4.7用磷酸鹽緩沖液洗滌介質(zhì)3次以上,每次15m以上h.

4.8抗原固相化完成，可用于純化。

4.9若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。

5.抗血清的純化和保存

5.1抗血清用PBS等體積稀釋，5000-10000 / min離心15分鐘，取上清.

5.2用10倍體積的PBS清洗抗原親和柱以平衡柱子。

5.3將稀釋好的抗血清10m加入平衡好的柱子中。

5.4室溫下輕輕混合搖動2-4小時，或4" C過夜

5.5用10倍體積的PBS清洗抗原柱，以洗去結(jié)合在柱子上的雜蛋白

5.6用2倍體積的抗體洗脫液洗滌柱子，以得到特異性抗體

5.7用10倍體積PBS平衡柱子

5.8用20%的酒精封存柱子，4'C保存。

在得到洗脫的抗體后，經(jīng)蔗糖或聚乙二醇濃縮后于PBS中透析除鹽，使用紫外可見分光光度計在波長280nm處測定抗體OD值，所得OD值除以1.35即為所測抗體的濃度，添加40-50%甘油置于20^C可長期保存。

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